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非洲猪瘟实验室诊断技术
发布日期:2019-09-20 

  非洲猪瘟的实验室诊断技术 

  本着接地气的原则,笔者尝试着对非洲猪瘟的实验室诊断技术,主要是荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附技术,展开分析讨论,供ASF防控参与者一同交流。商品化试剂盒常常做为技术的载体出现,这里不做任何厂家试剂盒的广告,仅从技术角度分析讨论。在讨论诊断技术之前,笔者提出ASF商品化试剂盒的选择原则。



  一、试剂盒选择原则

  1、敏感性比特异性更重要

  去年8月3日沈阳非洲猪瘟疫情确诊之前,我国并不是ASF疫区,根除非洲猪瘟病毒的过程中,诊断技术敏感性与特异性不能兼顾的情况下,敏感性比特异性显得更加重要。用ELISA方法检测ASFV抗体时,间接ELISA较阻断ELISA的敏感性有优势。OIE官方建立的方法,也是间接ELISA(OIE Terrestrial Manual 2012;Chapter2.8.1)。有条件的话,可以采用间接ELISA筛选,阻断ELISA复核。

  2、得到非洲猪瘟的实验室检测结果后,阳性结果必然一下子戳中神经,震撼不已,对于阳性结果必然会进行复核。倘若是假阳性,便是虚惊一场。反而阴性结果常常直接略过,不被重视,若此结果是假阴性,那后果将是灾难性的。

  真实阳性真实阴性

  检测阳性√√√×

  检测阴性×××√

  3、PCR和ELISA是非常成熟的技术,商品化试剂盒的方法建立难度不大,而用大量临床样品、田间样品和标准品对商品化试剂盒验证与质控的过程,能够体现出严谨的科学态度。国内首发非洲猪瘟疫情之前并非疫区,无法收集到阳性样品,自主研发的商品化试剂盒的验证存在现实困难。不过日前农业部公布的两批非瘟试剂盒应该经过了验证,实验室可以放心使用。重磅!肇庆大华农通过第二次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价

  二、荧光定量PCR

  笔者认为选择经OIE参考室验证的商品化试剂盒用于ASF监测排查,尽快掌握国内ASF疫情,快速处置,对ASF根除是有利的。部分商品化试剂盒在欧非等传统ASF疫区普遍使用,产品成熟而可靠。

  若采取统一“度量衡”,以便于全国检测结果数据的横向比对。采用OIE推荐的非洲猪瘟病毒扩增p72基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U),开展监测排查具有现实可行性。导致检测结果出现假阳性和假阴性结果的因素很多,假阳性的原因自查后会发现,而如何避免假阴性结果的出现,是在检测工作开始之前需要认真考虑的事情。qPCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量,除了引物以外,还需要提取试剂、预混液、对照试剂等。

  三、提供有效的检测样品是前提

  《非洲猪瘟现场排查手册》对样品的采集、包装与运输做出了详细说明,推荐使用“三重包装系统”,运送的样品必须附有做够的冷却材料(如冰袋),以防变质。确保送达实验室的待测样品是有效的,是开展检测工作的前提。实际基层采样工作中,低温保存和运输是存在现实困难的。在这一方面OIE参考实验室德国FLI实验室(Friedrich-Loeffler-Institute)做了很好的尝试,采用GenoTube拭子采样管做为采样工具,常温运输和保存送达实验室,开展qPCR核酸检测,ELISA和胶体金检测卡抗体检测。更欣喜的是FLI对非洲猪瘟的样品采集进行了验证。

  四、建立更严谨而合理的检测体系 设立内部阳性对照(IPC) 有效预防假阴性结果出现

  国内兽医实验室qPCR检测中会设立阴性对照和外部阳性对照,但却很少设立内部阳性对照(IPC)。Xeno IPC其实就是与所有物种基因组无交叉的核酸序列,被检测样品结果阴性,Xeno IPC检测结果阳性(Ct值预期范围是已知),有效证明无qPCR抑制剂存在,从而降低了假阴性结果的风险,对ASF这类重大动物疫病监测具有重要的意义。美国兽医实验诊断协会(AAVLD)在实验室指南中明确推荐Xeno IPC在qPCR检测过程中使用。

  五、选择高品质的核酸提取试剂和预混液

  PCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量。核酸提取试剂盒必须是通用型样品制备试剂盒,可满足实验室对多种样品类型检测需求,并对全血、脾脏、淋趋承、扁桃体和环境样品等进行过验证。模块化技术经过专门优化,能够从最广泛的样品类型之中纯化核酸,具有高简便性、性能一致性并节省时间和成本,从而帮助提高实验室的效率。预混液要求对酶进行优化,以帮助鉴定那些最重要的动物病原体靶标,严格开发的试剂稳定且一致,即使用于最具挑战性的动物样品,在PCR抑制剂存在的条件下也依然有效。简单易用的预混液都能帮助获得值得信赖的结果。

  六、环境样品的检测结果反应生物安全防护措施是否得当

  做好生物安全防护措施才能有效预防非洲猪瘟的传入已成为共识,问题来了,如何证明生物安全防护措施是否得当?构建完善的生物安全监控网络,有计划的采集动物体和环境样品进行qPCR检测,通过客观数据足以量化生物安全措施的防护程度。尤其是针对猪场交叉区域的出猪台、卖猪车、无害化处理车、员工澡堂地面等区域环境样品的检测。

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